储存条件

本试剂盒避光保存于-20°C；若频繁使用，也可置于4°C短期保存(限10天内用完)。

试剂盒内容

2× Real PCR Easy^TM Mix-SYBR：包含福际生物特别改造的热启动Taq DNA Polymerase、MgCl₂、优化配比的dNTPs和SYBR Green I、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。PCR反应时，只需将适当的裂解混合液、引物、DNase-ddH2O添加到2× Real PCR Easy^TM Mix-SYBR中即可用于PCR反应。

ROX Reference Dye：一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上，用于调整PCR加样误差所引起的 PCR管与管之间的差异。不同仪器所需ROX Reference Dye浓度不同，用户可以根据仪器的推荐浓度添加。

DNase-Free ddH2O：超纯水，用于

试剂盒原理

试剂盒使用了热启动Foregene Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreen I的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I荧光染料，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBRGreen I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I与双链DNA结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBRGreen I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

Real Time PCR引物设计原则

Forward Primer和Reverse Primer

进行Real TimePCR，引物设计非常重要。引物关系到PCR扩增的特异性、高效性等，可以参照以下原则进行引物设计：

u   引物长度：18-30bp。

u   GC含量：40-60%。

u   Tm值：引物设计软件，如Primer 5，可以给出引物的Tm值。上下游引物的Tm值应    尽量接近。也可以使用Tm计算公式：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。进行PCR时，一般选择低于引物Tm值5℃的温度作为退火温度（相应的提高退火温度可以增加PCR反应的特异性）。

u   引物及PCR产物：

v   设计引物PCR扩增产物长度**在100-150bp。

v   应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。

v   避免上下游引物3’端之间形成2个或2个以上的互补碱基。

v   引物3’端碱基不能存在多余3个连续的G或C。

v   引物自身不能存在互补结构，否则会形成发夹结构，影响PCR扩增。

v   引物序列中ATCG应尽量分布均匀，3’端碱基避免为T。

Probe

探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。一般按照以下原则进行Probe的设计：

u   探针位置尽可能地靠近上游引物。

u   探针长度应在15-45bp(**是20-30bp)，以保证结合特异性。

u   检测探针的DNA折叠和二级结构。

u   Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40%-70%。

u   探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

u   整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

u   为确保引物探针的特异性，**将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。